H9N2 AIV的NS1基因原核与真核表达及NS1蛋白对几种细胞凋亡的影响

H9N2 AIV的NS1基因原核与真核表达及NS1蛋白对几种细胞凋亡的影响
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H9N2 AIV的NS1基因原核与真核表达及NS1蛋白对几种细胞凋亡的影响
摘要5-6 ABSTRACT6-11 第一章 禽流感病毒研究进展11-24 1.1 禽流感概述11-12 1.2 禽流感病毒的一般生物学特性12-14 1.2.1 AIV 的分类地位12 1.2.2 AIV 的形态特征12-13 1.2.3 AIV 的理化特性13 1.2.4 AIV 的抗原性和基因型变异13-14 1.2.5 AIV 的生态学与流行病学变化14 1.3 AIV 的分子生物学研究进展14-19 1.3.1 AIV 的基因组结构14-15 1.3.2 AIV 基因编码蛋白的结构和功能15-18 1.3.3 AIV 宿主特异性的分子生物学基础18-19 1.4 AIV 分子生物学检测方法研究进展19-21 1.4.1 聚合酶链式反应19-20 1.4.2 逆转录-环介导等温核酸扩增技术20-21 1.4.3 基因芯片技术21 1.5 禽流感疫苗研究进展及展望21-23 1.5.1 禽流感全病毒灭活疫苗21-22 1.5.2 基因工程亚单位疫苗22 1.5.3 基因重组活载体疫苗22 1.5.4 核酸疫苗22 1.5.5 具有交叉保护性的通用疫苗22-23 1.5.6 新型疫苗23 1.6 本研究的目的和意义23-24 第二章 H9N2 亚型AIV NS1 基因在大肠杆菌中的表达24-39 2.1 材料24-28 2.1.1 毒株和鸡胚24 2.1.2 阳性血清和标准抗原24 2.1.3 载体及菌种24 2.1.4 主要试剂及溶液配制24-28 2.1.5 主要仪器28 2.2 方法28-34 2.2.1 病毒增殖28 2.2.2 PCR 引物的设计与合成28-29 2.2.3 病毒总RNA 的提取29 2.2.4 NS1 基因的RT-PCR29 2.2.5 PCR 产物的纯化回收29-30 2.2.6 PCR 产物与T 载体连接30 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备30 2.2.8 转化30-31 2.2.9 克隆化质粒的提取及鉴定31 2.2.10 目的基因与表达载体的连接、转化及鉴定31-32 2.2.11 重组质粒在大肠杆菌中的表达32 2.2.12 表达蛋白的SDS-PAGE 检测32-33 2.2.13 表达蛋白的western-blotting 分析33-34 2.3 结果与分析34-37 2.3.1 鸡胚接种及病变观察34 2.3.2 NS1 基因的RT-PCR 扩增34 2.3.3 NS1 基因的克隆34-35 2.3.4 NS1 基因原核重组质粒的酶切鉴定35 2.3.5 NS1 基因测序结果分析35-36 2.3.6 NS1 基因大肠杆菌表达产物的SDS-PAGE 分析36 2.3.7 重组质粒pET-NS1 原核表达产物的Western - blotting 分析36-37 2.4 讨论37-38 2.5 小结38-39 第三章 H9N2 亚型AIV NS1 蛋白在293 细胞中的瞬时表达39-48 3.1 材料39-40 3.1.1 病毒39 3.1.2 载体、菌株和细胞系39 3.1.3 工具酶和主要试剂39-40 3.1.4 主要溶液的配制40 3.2 方法40-43 3.2.1 引物设计40-41 3.2.2 病毒总RNA 的提取41 3.2.3 NS1 基因的RT-PCR 扩增41 3.2.4 PCR 产物的纯化回收41 3.2.5 PCR 产物与pMD18-T simple 载体连接41 3.2.6 DH5a 大肠杆菌感受态细胞的制备41 3.2.7 连接产物的转化41 3.2.8 重组质粒的鉴定41-42 3.2.9 AIV NS1 真核重组表达质粒的构建42 3.2.10 AIV NS1 真核重组表达质粒在细胞中的表达42-43 3.2.11 pEGFP-C1-NS1 转染293 细胞的Western –blotting 检测43 3.3 结果43-46 3.3.1 NS1 基因的RT-PCR 扩增43-44 3.3.2 NS1 基因的重组质粒PMD-NS1z 构建44 3.3.3 NS1 基因真核重组表达载体pEGFP -NS1 的构建44-45 3.3.4 重组质粒转染293 细胞后在荧光显微镜下的照片45-46 3.3.5 NS1 基因转染293 细胞瞬时表达产物的Western - blotting 分析46 3.4 讨论46-47 3.5 小结47-48 第四章 H9N2 亚型AIV NS1 蛋白对几种细胞凋亡的影响48-55 4.1 材料48 4.1.1 质粒和细胞系48 4.1.2 主要试剂48 4.2 方法48-50 4.2.1 转染质粒的提取及其浓度、纯度的检测48-49 4.2.2 NS1 基因真核重组表达质粒瞬时转染细胞49 4.2.3 凋亡检测49-50 4.3 结果50-53 4.3.1 目的质粒转染MDCK 细胞检测结果50-51 4.3.2 目的质粒转染Vero 细胞检测结果51-52 4.3.3 目的质粒转染293 细胞检测结果52-53 4.3.4 目的质粒引起几种细胞凋亡情况分析53 4.4 讨论53-54 4.5 小结54-55 结论55-56 参考文献56-61 缩略词表61-62 致谢62-63 作者简介63