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目的：测定肿瘤组织异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(FITC?dextran)粘附水平是否可作为肿瘤血管密度的量化指标.方法：用endolgin疫苗免疫小鼠后,在同一只小鼠上同时建立小鼠Meth A纤维肉瘤模型和藻酸盐包被肿瘤细胞试验模型,2周后将FITC?dextran注射入小鼠体内,然后手术完整摘取肿瘤组织和藻酸盐颗粒,取部分肿瘤组织进行免疫组化检测血管密度的同时,将其他组织和藻酸盐颗粒匀桨并离心,取上清检测荧光强度,分析二者之间是否存在直线相关关系.结果：免疫组化和肉眼观察显示2种测定方法均有明显的血管生成效应,用FITC?dextran粘附测定肿瘤组织血管相对密度和藻酸盐包被试验均能较好地量化测定抗血管生成效果,直线相关分析表示二者的疫苗免疫实验组FITC?dextran的测定值之间呈明显的正性相关关系（r = 0.962,P＜0.01）.结论：和藻酸盐包被试验相比,FITC?dextran测定肿瘤组织血管相对密度是一种简单有效的量化测定肿瘤组织血管生成水平的方法.
【关键词】 肿瘤；血管；动物模型；藻酸盐包被肿瘤细胞试验
Quantitative determination of relative tumor vascularity by FITC?dextran adsorption
TAN Guang?hong, HUANG Feng?ying, WANG Hua, et al.
( Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Medicine, Haian Medical College, Hainan, Haikou 571101, P.R. of China)
〔ABSTRACT〕 Objective: To evaluate whether determination of FITC-dextran adsorption in tumor tissues is suitable for quantitative evaluation of tumor angiogenesis. Methods: After induction of antiangiogenic immunity in mice using xenogenic endogin protein, Meth A fibrosarcoma tumor cells were incubated in the conventional method of setting tumor model. Alginate?encapsulate tumor cell assay was performed on the same mouse at the same time, and no immune mice were used as control as well. 14 days later, alginate beads and the whole tumor tissue were removed surgically and quantified the uptake of FITC?dextran, and partial tumor tissues were used for immunohistochemistry determination of the vessel density, using antibody reactive to CD31. In addition, linear correlation analysis was used to evaluate the relationship. Results: The antiangiogenic effects were significantly induced in the two models respectively, and linear correlation analysis of the uptake of FITC?dextran showed significant positive correlations between the two vaccine?immunized treated groups in the two models (r=0.962, P＜0.01). Conclusion: Determination of relative tumor vascularity in the tumor tissue using FITC?dextran adsorption can be used as an antiangiogenic model in vivo.
〔KEY WORDS〕 Tumor; Blood vessel, Animal model, Alginate?encapsulate tumor cell assay
肿瘤的发生、发展和转移与血管生成（angiogenesis）密切相关.我们在研究实验中发现〔1,2〕,如果抗肿瘤血管生成的治疗方案确实有效,除了表现为肿瘤体积较小,生存时间延长外,在肿瘤的组织切片中也表现为血管密度明显减少.藻酸盐包被肿瘤细胞模型是目前定量测定肿瘤血管生成的标准方法〔3〕,它的主要原理是将异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FITC?dextran）注射进入体内后,葡聚糖就会粘附于内皮细胞表面、部分可能被内皮细胞吸收而滞留于血管腔中.通过测定藻酸盐颗粒中的葡聚糖的荧光强度并和标准曲线相比较,就可得到量化的结果.因此我们设想,如果肿瘤组织中血管密度相对较少,肿瘤组织的血管粘附、吸收和滞留葡聚糖的数量也应该相应减少,通过比较不同肿瘤组织吸收FITC?dextran相对荧光强度,就能够量化了解不同肿瘤组织的血管密度.本研究将FITC?dextran注射于活体荷瘤小鼠中,然后测定肿瘤组织FITC?dextran水平并和藻酸盐包被模型相比较,了解二者之间是否存在相关关系.
1 材料与方法
1.1 实验材料

FITC?dextran购自Sigma Chemical公司,藻酸钠(Alginic Acid,Sodium Salt)购自Sigma Chemical 公司,苯巴比妥钠购自上海新亚药业有限公司,RPMI?1640培养基和胎牛血清(FCS)购自美国GibicoBRL公司.重组猪endoglin蛋白为作者构建表达并纯化〔1〕.6～8周龄雌性BALB/c小鼠购自四川大学动物中心,小鼠Meth A 纤维肉癌（Meth A）细胞株由生物治疗国家重点实验室（四川大学）赠送.大鼠抗小鼠CD31(PECAM?1)单克隆抗体购自BD Pharmingen公司,VECTASTAIN Elite ABC Kit 购自Vector Laboratories公司.荧光酶标仪Microplate Fluorescence Reader,FL600,为Bio?Tek公司产品.
1.2 实验方法
1.2.1 免疫方法 将重组endoglin蛋白冻干粉剂于无菌条件下称量,溶于无菌的生理盐水(NS)中,与灭菌的氢氧化铝凝胶佐剂〔A〕(OH)3按4∶1(V/V)混匀（氢氧化铝终浓度约为2 mg/mL）,室温下放置30～60 min.然后将实验小鼠随机分两组,每组各10只.实验组小鼠每只背部皮下注射上述混合好的endgolin蛋白疫苗每次10 μg(100 μL).对照组每只小鼠注射NS:佐剂为4∶1的混合液100 μL.每组注射均为1周1次,共4次.
1.2.2 细胞培养 从液氮中取出冻存保种的Meth A细胞,迅速置于37 ℃水浴复温融化,在超净工作台内用培养基洗涤1次.然后用完全培养基于37 ℃,5% CO2培养箱中培养.收集对数生长期细胞,1 500 rpm离心3 min,细胞沉淀用无抗生素无血清的培养基洗涤1次,计数细胞数量后用无抗生素无血清的培养基调整细胞浓度至1×107/mL.
1.2.3 藻酸盐包被模型的建立 按文献进行〔3〕,略加改进.无菌条件下,首先将藻酸钠溶于无菌生理盐水,终浓度为1.5% (W/V)；并将收集培养的肿瘤细胞重悬于1.5%藻酸钠溶液中,然后用1 mL加样枪将细胞和藻酸盐混合液缓慢滴入磁力搅拌的250 mM CaCl2溶液中,形成乳白色的小珠.实验前进行预实验,使每个小珠约含有2×105个细胞.继续静置于250 mM CaCl2中30 min即可使用.此后将第4次免疫7 d后的小鼠用苯巴比妥钠0.1 mL (100 mg/kg)腹腔注射麻醉.小鼠麻醉后置于解剖台上,切开背部皮肤,在切口左侧下方上下不同部位各植入1粒按上述方法制备好的藻酸盐小珠,缝合皮肤.14 d以后,从尾静脉注入100 μL(100 mg/kg) FITC?dextran,30 min后断颈处死,取出藻酸盐小珠,常温下加入0.5 mL的生理盐水,混匀标本,放置1 h, 1 500 rpm离心5 min.取上清液200 μL用荧光酶标仪测定荧光强度,用不同浓度的FITC?dextran制备标准曲线,得出每只小鼠的测定值.
1.2.4 小鼠肿瘤模型的建立 上述藻酸盐小珠植入小鼠体内后,同时将Meth A细胞接种到每只小鼠的右侧胁肋部皮下,每只接种2×106个细胞(0.2 mL).14 d后断颈处死,在取出藻酸盐小珠的同时,用手术器械分离出完整的肿瘤组织,准确称重后剪碎肿瘤组织,按重量每克肿瘤组织加入生理盐水2 mL,磨碎成匀浆,在摇床上摇动1 h后1 500 rpm离心5 min,同样取上清200 μL测定荧光强度,对照相应标准曲线得出各个标本的测定值.
1.2.5 肿瘤组织血管免疫组化染色 参考文献〔1,2〕取各组新鲜肿瘤组织进行冰冻切片.抗CD31免疫组化方法按Vector Laboratories公司试剂盒操作说明书进行.肿瘤组织微血管定量也按相关文献报道方法进行〔1,2〕.
1.3 统计学分析

模型内肿瘤体积和荧光强度比较用Student's T检验,模型间相关性用线性相关分析.
2 结果
2.1 肿瘤生长和免疫组化检测肿瘤血管密度

用重组猪的endoglin蛋白作为抗肿瘤血管生成疫苗具有明显的抑制肿瘤生长和抗血管生成的作用,疫苗免疫组肿瘤生长明显慢于非免疫对照组；疫苗免疫组和非免疫对照组肿瘤重量分别为(0.52±0.13) g和(2.37±0.31) g（P＜0.001）,（图1 A）.14 d后处死小鼠,用抗CD31免疫组化染色肿瘤组织血管,和非免疫对照组相比（图1C）,结果发现,疫苗免疫组肿瘤组织血管明显减少（图1D）,疫苗免疫组和非免疫对照组肿瘤组织血管密度平均每高倍视野分别为(10.82±3.91)和(46.58±8.73)（P＜ 0.001）（图 1 B）.

注：A：肿瘤重量；B：微血管密度定量分析；C：疫苗免疫治疗组肿瘤组织免疫组化；D：非免疫对照组肿瘤组织免疫组化；Trea：疫苗免疫治疗组；Cont：非免疫对照组.
图1 Endoglin重组蛋白抑制肿瘤血管生成（略）
2.2 FITC?dextran粘附测定肿瘤组织血管生成状况

肿瘤细胞接种14 d后处死小鼠,经尾静脉注射FITC?dextran,取出肿瘤组织后测定相对的FITC?dextran粘附数量,疫苗免疫组和非免疫对照组FITC?dextran 的粘附量分别为(2.53±0.82) μg和(7.56±1.27) μg,统计分析表明两组间具有显著性差异（P＜0.001）（图2 A）.
2.3 藻酸盐包被实验测定肿瘤组织血管生成效应

当14 d后切开植入藻酸盐颗粒部位的皮肤后,肉眼就可看见疫苗免疫组（图 2 C）的藻酸盐颗粒表面几乎没有可见的血管,而非免疫对照组的藻酸盐颗粒（图 2 D）均见有明显的血管分布,疫苗免疫组FITC?dextran 的粘附量也明显低于非免疫对照组,分别为(0.76±0.35) μg和(2.34±0.79) μg,统计分析表明两组间同样具有显著性差异（P＜0.001）（图2 B ）.
2.4 肿瘤组织FITC?dextran粘附与藻酸盐包被实验测定相关性分析

将肿瘤组织与藻酸盐包被实验测定疫苗免疫实验组的FITC?dextran粘附量数值进行相关性分析,将这两组数值代入直线相关公式求出相关系数r值,并进行假设检验,结果相关系数r=0.962,假设检验P＜0.001,表明二者之间呈明显的直线正相关（图3）.
注：A：肿瘤组织直接测定的FITC?dextran量；B：藻酸盐包被肿瘤细胞试验测定的FITC?dextran量；C：疫苗免疫治疗组藻酸盐小珠；D：非免疫对照组藻酸盐小珠；Trea：疫苗免疫治疗组；Cont：非免疫对照组.
图2 肿瘤组织直接测定FITC?dextran和藻酸盐包被肿瘤细胞试验（略）
图3 肿瘤组织直接测定和藻酸盐包被肿瘤细胞试验测定的FITC?dextran呈直线正相关（略）
3 讨论

Endoglin是一种细胞膜表面分子,主要表达于激活的内皮细胞表面；研究证实endoglin是肿瘤血管生成的一个新的标志〔4〕,用抗endoglin抗体在动物肿瘤模型中已取得了良好的抗血管和抑制肿瘤生长的效果〔5,6〕.本研究所应用的猪endoglin是我们从猪胚肝中克隆得到cDNA的基础上,将其构建于原核表达载体,然后诱导表达并经严格纯化得到的重组蛋白质.在以往的研究中,我们已经证实用这种重组蛋白作为小鼠endoglin的异种同源蛋白疫苗,免疫小鼠能诱导小鼠产生抗猪和鼠自身endoglin的抗体,并且在多个肿瘤模型中发现具有抗肿瘤血管生成从而明显抑制肿瘤生长的作用〔1,2〕.本研究用免疫组化和藻酸盐包被肿瘤细胞实验都发现用猪的endoglin 重组蛋白作为疫苗免疫小鼠后,确实具有抗小鼠Meth A纤维肉瘤血管生成的作用.

抗肿瘤血管生成研究是当今肿瘤研究中的一个热点,几乎每天都有新的研究成果发表于不同的学术刊物上,因此,一种简便有效而又能够定量的抗血管生成模型对肿瘤抗血管生成研究具有十分现实的意义.当前,研究中常用的抗肿瘤血管生成模型主要包括：角膜模型、鸡胚内囊膜模型和藻酸盐包被肿瘤细胞模型等,前者需要在小鼠的角膜上进行微创手术,一般实验者很难掌握,实验结果难以量化处理.而鸡胚内囊膜模型的操作也比较复杂,许多药物还不适合用于此模型,同样也难以进行量化处理.藻酸盐包被模型尽管能准确量化,并且能从外观上看出抗血管生成效果,但是需要进行麻醉和手术,在这个过程中实验小鼠很容易死亡.另外,藻酸盐浓度控制得不好或是操作过程中出错都可导致包被于藻酸盐中的肿瘤细胞死亡,影响实验结果.在本研究中,我们直接用接种2周的肿瘤组织为研究对象,因为任何有效的抗肿瘤血管生成的治疗都会抑制肿瘤血管生成,致使肿瘤生长减慢,除了表现为肿瘤体积减少和重量较轻以外,整个肿瘤组织血管密度和血管腔容积也应该相应减少.因此,当从外周把FITC?dextran灌注进机体后,在相同重量的肿瘤组织中,血管密度和血管容积均减少的肿瘤组织粘附、吸收和滞留FITC?dextran的量也应该相对减少,这样通过测定相同重量的不同肿瘤组织就可以量化比较出这些差异,本研究的实验结果完全支持这些观点.经相关分析,实验结果和现在文献常用的藻酸盐包被肿瘤细胞实验结果呈显著的直线正性相关关系.但是,由于直接测定肿瘤组织血管相对密度的操作方法就是常规的建立肿瘤模型的方法,具有过程简单,易于操作等优点.尽管目前文献尚未见有实际应用的报道,但是我们认为这一种直接测定肿瘤组织粘附FITC?dextrane进而量化肿瘤血管相对密度的方法实用可行,具有推广应用的价值.
【参考文献】
1 Tan GH, Wei YQ, Tian L, et al. Active immunotherapy of tumors with a recombinant xenogeneic endoglin as a model antigen 〔J〕. Eur J Immunol, 2004,34(7):2012?2021.
2 Tan GH, Tian L, Wei YQ, et al. Combination of low?dose cisplatin and recombinant xenogeneic endoglin as a vaccine induces synergistic antitumor activities〔J〕. Int J Cancer,2004,112(4):701?706.
3 Hoffmann J, Schirner M, Menrad A, et al. A highly sensitive model for quantification of in vivo tumor angiogenesis induced by alginate?encapsulated tumor cells 〔J〕. Cancer Res,1997,57(17):3847?3851.
4 Fonsatti E, Vecchio LD, Altomonte M, et al. Endoglin: an accessory component of the TGF?β?binding receptor?complex with diagnostic, prognostic, and bioimmunotherapeutic potential in human malignancies 〔J〕. J Cell Physiol,2001,188(1):1?7.
5 Seon BK, Matsuno F, Haruta Y, et al. Long?lasting complete inhibition of human solid tumors in SCID mice by targeting endothelial cells of tumor vasculature with antihuman endoglin immunotoxin 〔J〕. Clin Cancer Res,1997,3(7): 1031?1044.
6 Matsuno F, Haruta Y, Kondo M, et al. Induction of lasting complete regression of preformed distinct solid tumors by targeting the tumor vasculature using two new anti?endoglin monoclonal antibodies 〔J〕. Clin Cancer Res,1999,5(2):371?382.