在纯化蛋白时,如何重复使用柱子及柱料?用his柱纯化的

来源：学生作业帮助网编辑：作业帮时间：2024/05/07 15:32:08

在纯化蛋白时,如何重复使用柱子及柱料?用his柱纯化的
在纯化蛋白时,如何重复使用柱子及柱料?
用his柱纯化的

在纯化蛋白时,如何重复使用柱子及柱料?用his柱纯化的
那就是ni-NTA的填料,几大厂家的nta填料都是比较耐碱的,在上轮实验后,可以先用纯水过5-10个柱体积,再用0.5N的NaOH过5个柱体积（15min-30min时间）,再过至少10个柱体积的纯水（确保NaOH清除干净,可用ph试纸查ph至中性）,如果短时间不用,就用20%无水乙醇保柱.
如果是多次使用后发现蛋白挂不上,或填料发白,就说明填料上ni脱落的厉害,需要重生,这就要看你填料的说明书要求,但一般过程是差不多的,你写下,你参考：
（1）过5体积纯水平衡柱子；
（2）过5体积NaOH（0.5N）,15-30min时间；
（3）纯水10体积；
（4）依次10%、20%、50%、70%、90%无水乙醇3体积；
（5）100%无水乙醇5体积；
（6）依次90%、70%、50%、20%、10%无水乙醇3体积；
（7）纯水10体积
（8）EDTA2Na(50nM),这是脱ni,要洗至填料变白；
（9）纯水20体积；
（10）100mM的NiSO4（硫酸镍）,5体积（流速要慢,可多过几个体积）,重新上ni；
（11）纯水10体积；
这就重新挂ni了,填料应该重现微蓝色,可再使用.但就我的经验,一般填料重生3次以上后,其效果就不乐观了,现在ni-nta也不贵,如果实验比较重要,建议使用新填料.
欢迎继续讨论,纯属手打,祝实验顺利!

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