作业帮PCR扩增目标基因,完全没有条带.是不是设计的引物太短?引物只有10个碱基和模板配对
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/05/14 07:48:47
PCR扩增目标基因,完全没有条带.是不是设计的引物太短?引物只有10个碱基和模板配对
PCR扩增目标基因,完全没有条带.是不是设计的引物太短?引物只有10个碱基和模板配对
PCR扩增目标基因,完全没有条带.是不是设计的引物太短?引物只有10个碱基和模板配对
为什么只有10个碱基配对呢?引物总长多少?
如果目的片段构建克隆了，用质粒试试。
如果引物3撇末端与模板是正确配对的，可以降低退火试试。
楼主的实验背景是怎样的？引物5撇端有修饰吗？退火温度应该没有问题，是按照引物合成说明书上的Tm值减去5度。 5端还有酶切位点和3个保护碱基。 实验是为了将质粒中的基因克隆出来。降低退火后 引物更容易与模板结合 当引物与模板不完全配对时会提高扩增效率 但是会降低引物的特异性，很容易出现...
全部展开
如果目的片段构建克隆了，用质粒试试。
如果引物3撇末端与模板是正确配对的，可以降低退火试试。
楼主的实验背景是怎样的？引物5撇端有修饰吗？
收起
引物是短了，一般要20bp，最少也要18bp，再加上酶切位点和保护碱基。
一般配对碱基数都要在15个或以上
还有就是引物单上的退火温度是根据19bp全配对计算的，你忽略了9bp未配对。真正的应该是就算你那10个配对的碱基产生的Tm
引物短了点，一般18-25bp,上30bp都可以。primer 5软件设计的时候，软件是设计的10bp的？不是吧？
另外，是不是看看解链温度，PCR仪导热不太好，DNA双链有可能没解开，这个是许许多多PCR失败的关键原因。不是PCR仪的问题，因为实验室大家都在用。那你重新设计下引物吧。应该是用的primer5 辅助设计的吧，我觉得这是个很好的软件...
全部展开
引物短了点，一般18-25bp,上30bp都可以。primer 5软件设计的时候，软件是设计的10bp的？不是吧？
另外，是不是看看解链温度，PCR仪导热不太好，DNA双链有可能没解开，这个是许许多多PCR失败的关键原因。
收起